细胞坏死的基因活动

  作者：宋铁芳

  [关键词] 肿瘤细胞

  砷剂，主要成分为三氧化二砷（As2O3），在祖国医药中被称为砒石。几世纪以前

  ，砷剂就被人们用来治疗牛皮癣、风湿症、白血病、梅毒、痔疮等。目前临床上砷

  剂的应用主要限于用有机砷治疗锥虫病或三氧化二砷作牙髓失活剂。哈尔滨医科大

  学首先报道了静脉滴注As2O3治疗复发的急性早幼粒细胞白血病（APL）达到很高的

  完全缓解率后，上海血液研究所发现As2O3可诱导APL细胞凋亡和部分分化。近年来

  ，国内外对砷剂与肿瘤的研究发展很快，发现砷剂对恶性淋巴系统疾病、红白血病

  甚至实体瘤有令人振奋的治疗效果。现就其生化作用及对肿瘤的诱导凋亡作用作一

  综述。

  1　砷的生化作用

  砷作为微量元素，存在于正常人体内。其化学形式可分为三价砷(无机砷)和五价砷

  (有机砷)，它们在体内的相互转换和代谢决定着砷的毒性作用。三价砷毒性较大，

  易在体内蓄积，主要经胃肠道缓慢排泄;而五价砷则相对毒性较低，蓄积倾向低，

  主要经肾脏较快排泄。进入人体后的三价砷在肝脏内还原发生甲基化，形成一甲胂

  酸(MMA)或二甲胂酸(DMA)，从而被解毒。

  砷是一种细胞原浆毒，细胞内的相邻巯基是三价砷的主要化学受体。应用含巯基的

  还原型谷胱甘肽可阻断砷剂的毒性作用。含大量巯基的还原型角蛋白结合砷剂的量

  为含较少巯基的氧化型角蛋白结合砷剂量的十倍。砷剂与酶分子内的巯基作用后可

  抑制其活性。受影响的重要酶系统有丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、磷酸酯酶、细

  胞色素氧化酶、脱氧核糖核酸聚合酶、白介素1β转化酶（ICE）等，从而直接影响

  了细胞的代谢过程、染色体结构、核分裂等。

  线粒体是对砷剂作用最敏感的细胞器，三价砷消耗了线粒体内亲水的巯基后，干扰

  了线粒体内的离子平衡以及NAD(P)H的氧化，从而干扰了线粒体的能量代谢，引起

  细胞功能的紊乱。砷剂是否对正常细胞有毒性作用取决于剂量，如As2O3治疗APL有

  效血浓度及体外研究其对肿瘤细胞作用的有效浓度均在0.1μM～2.0μM，实验表明

  As2O3在此浓度下对造血干细胞影响甚小[1]。

  2　砷剂对肿瘤细胞的诱导凋亡作用

  与正常细胞不同，肿瘤细胞生长失控，分化或凋亡受阻。近年来研究表明砷剂既可

  诱导肿瘤细胞凋亡、部分分化，也可抑制其增殖。多项研究表明诱导凋亡为其杀伤

  肿瘤细胞的主要机制。

  2.1　开放MPT，活化caspase家族

  研究表明，细胞凋亡发生的关键环节不在细胞核而在细胞质。虽然凋亡细胞呈现一

  系列的特征性形态学变化，但这些改变仅仅是细胞凋亡的结果。凋亡细胞在被诱导

  产生特征性形态学改变和DNA降解之前，一个最普遍的变化是线粒体膜功能的改变

  即线粒体的通透性改变(permeability transition，PT)，这是调节凋亡的中心环

  节。线粒体通透性转运孔道(MPT)是位于线粒体内外膜之间的多蛋白复合体，至少

  包括胞质的己糖激酶、外膜的PBR、外室的肌酸激酶、内膜的ANT及基质的亲环蛋白

  D（cyclophilin D）等。MPT通过调节线粒体基质中的Ca2＋、pH和电荷，维持线粒

  体内环境稳定，保证氧化磷酸化通路通畅，对凋亡控制具有重要作用。砷剂与巯基

  结合后，导致MPT开放，线粒体跨膜电位(△ψm)下降或消失，继之呼吸链脱偶联，

  谷胱甘肽耗竭，活性氧类（reactive oxygen species，ROS）产生及对诱导凋亡非

  常重要的蛋白酶活化物的释放，包括细胞色素C(Cyto-C)和凋亡诱导因子(AIF)，

  Cyto-C和 AIF均可激活caspase，caspase可诱导凋亡。

  caspase即半胱氨酸蛋白酶家族。在NB4（一种APL细胞系），U937及SH?SY5Y成神

  经细胞瘤等细胞系中均可见As2O3等砷剂诱导的凋亡相关的caspase激活[2，3]。根

  据其在细胞凋亡中的作用可分为始动(上游)caspase(caspase2，8，9，10)和效应

  (下游)caspase(caspase3，6，7)两大类。前者在凋亡诱导信号作用下结合特异辅

  因子而活化，并进一步活化后者。而caspase抑制剂(Z?VAD，fmk等)可阻止砷剂诱

  导的凋亡。因而caspase的活化级联形式是砷剂诱导凋亡的重要通路。综上所述，

  砷剂引起的MPT开放和△ψm破坏是决定细胞生存与否的关键，而caspase是砷剂诱

  导凋亡的下游效应物，其活化可诱导细胞凋亡。

  2.2　改变细胞内氧化还原状态

  细胞内ROS的产生和抗氧化代谢的平衡往往是决定细胞生存与否的关键。蛋白的氧

  化作用可能是改变核基因转录的重要步骤，氧化作用通过基因转录改变细胞的表型

  以便进一步启动凋亡的发生，且凋亡的最后阶段需要氧化过程的参与，如细胞膜蛋

  白的氧化能开放离子通道间接地导致细胞皱缩，通过组蛋白的氧化修饰作用导致染

  色体结构的改变。砷剂可使细胞内ROS生成增多是由于：（1）MPT开放，线粒体内

  氧化呼吸链受阻，致ROS外漏。（2）活化黄素蛋白依赖的超氧化物酶（如NADPH氧

  化酶），使H2O2产生增多，后者可通过从线粒体释放Cyto-C，活化caspase-3并裂

  解多聚ADP核糖多聚酶(PARP)而介导凋亡（PARP在DNA受损时可识别并结合到DNA断

  裂处被激活而参与DNA的修复，是细胞凋亡中第一个被鉴定为由caspase-3降解的D

  NA修复酶）；又可通过与线粒体巯基形成复合物而降低GSH的活性等途径使ROS清除

  减少。故砷剂可通过改变细胞内的氧化还原状态诱导凋亡。但将细胞培养于氧浓度

  低于10ppm不可能产生ROS的条件下，仍可发生凋亡，故这可能只是机制之一。

  2.3　快速调变PML?RARα融合蛋白的亚细胞定位

  APL细胞特征性染色体易位t(15;17)导致早幼粒细胞白血病基因(PML)和维甲酸受体

  α基因(RARα)融合，表达PML-RARα融合蛋白。通过转基因小鼠实验可证实PML-R

  ARα融合蛋白是APL发病的主要分子基础。体外研究表明，PML-RARα融合蛋白既阻

  断APL细胞的分化，也使APL细胞凋亡受阻。早期认为砷剂通过降解此蛋白而诱导A

  PL细胞凋亡，称之为维甲酸受体信号通路[4]。正常血细胞中野生型PML与RARα等

  共定位于核体(PODs)中。大多数APL细胞因PML-RARα与PML形成异二聚体而使PODs

  结构解体，阻止细胞分化及抑制凋亡。砷剂使PML， PML-RARα重新共定位于PODs

  并快速降解之。该现象与APL细胞凋亡以及二硫键还原剂二硫苏糖醇(DTT)抑制NB4

  细胞凋亡与抑制PML-RARα快速降解在时相上均有一定的相关性，被认为是砷剂治

  疗APL的机制之一。但有实验显示[5]，在PML－小鼠(不含PML基因的小鼠)，As2O3

  同样能抑制细胞增殖及诱导凋亡，且其诱导凋亡效应不仅见于APL细胞，还可见于

  非霍奇金淋巴瘤细胞、慢性淋巴细胞白血病细胞及某些正常细胞，故其诱导凋亡机

  制是非特异性的，维甲酸受体信号通路并非是砷剂诱导凋亡的惟一机制。

  2.4　抑制Bcl-2基因

  Bcl-2基因即细胞淋巴瘤/白血病-2基因是研究最早的与凋亡有关的基因[6～9]，是

  一种凋亡抑制基因，又称长寿基因，是维持癌细胞无限制生长的主要基因。Bcl-2

  家族包括Bcl-2、Bax、Bcl-X、Bcl-w、Bak、Bad、A1 、NR-13和Mcl-1，其中Bax、

  Bak、Bcl-Xs是促凋亡因子，其余为抗凋亡因子。Bcl-2对细胞周期无明显影响，而

  对细胞死亡的干扰有选择性，阻止了细胞死亡的最后途径，包括核苷酸内切酶对D

  NA的降解。Bax是Bcl-2的一种同源蛋白，Bax既可以形成同聚体，又可与Bcl-2形成

  异二聚体，Bax蛋白与Bcl-2蛋白的比值影响着细胞受到刺激后发生凋亡的比率。目

  前认为，Bcl-2家族促凋亡因子和抗凋亡因子的相对表达水平至少部分决定了细胞

  对凋亡信号的反应性。大量实验表明，Bcl-2与Bcl-X l能够抑制MPT开放和维持线

  粒体△ψm，进而抑制Cyto_C和AIF从线粒体释放入胞浆并阻断了ROS的生成，增加

  胞内GSH含量并促进其向核内转移，即有细胞内抗氧化作用。在砷剂诱导的NB4、U

  937及B细胞白血病细胞系LyH7细胞凋亡中Bcl-2表达下调[10]。在1.0μM As2O3诱

  导NB4细胞凋亡时[11],CPP32（caspase3）被激活和降解PARP，同时Bcl-2不仅在m

  RNA水平而且在蛋白质水平均被下调；而在1.0μM As2O3诱导恶性淋巴性白血病细

  胞凋亡过程中既无CPP32激活又无Bcl-2调变，提示砷剂诱导的凋亡中Bcl-2发挥的

  作用各异。有实验表明，2.5μM As2O3[12]使肝癌细胞系Hep201Bcl-2表达明显下

  降，而凋亡的促进因子Bax的表达明显增加，两种基因表达比例发生变化。又有报

  道，10μM As2O3处理人肝癌QGY-5401、QGY-5403细胞48小时后其Bcl-2基因表达明

  显下降，Bax和Fas基因表达明显增强，Bax蛋白与Bcl-2蛋白比值增加。对Bax、Bc

  l-Xl等基因是否表达各报道不同[13～15]。Bcl-2的过度表达可抑制砷剂诱导的凋

  亡相关现象，而通过反义技术使Bcl-2下调可抑制细胞增殖及促进凋亡。综上所述

  ，砷剂可通过对Bcl-2基因的抑制诱导某些肿瘤细胞的凋亡。但As2O3并不影响恶性

  淋巴瘤细胞及某些成神经细胞瘤细胞系Bcl-2（Bcl-Xl）的表达，提示Bcl-2可能不

  是参与诱导以上细胞凋亡的主要中介。

  2.5　抑制NF-κB的活化

  核转录因子NF-κB（nuclear factor-κB）是1986年首先于B细胞中发现的一种结

  合于免疫球蛋白κ轻链增强子上的核蛋白[16]。在正常情况下，NF-κB与其抑制物

  IκBα结合，存在于细胞浆中，IκBα遮蔽着NK-κB的基因定位序列（NLS），NF

  -κB的生物学活性不表现出来。当细胞受到外界因素（包括细菌或病毒感染、炎症

  细胞因子、TNF、LPS、紫外线照射、电离辐射）等刺激时，IκBα将发生磷酸化并

  迅速降解，NF-κB就被释放、激活并转入细胞核内调控一系列的基因表达。其中，

  NF-κB在肿瘤细胞中发挥着重要的抗凋亡作用，因此，抑制肿瘤细胞NF-κB的活性

  将引起肿瘤细胞的凋亡，从而抑制肿瘤的生长。有研究表明[17]，As2O3可强烈抑

  制HTLV-1和HTLV-2（human T-cell leukemia virus type 1,2）细胞的IκBα磷酸

  化，使NF-κB不能进入细胞核中，即抑制了NF-κBN的活化。启动子为NF-κB依赖

  性的抗凋亡蛋白Bcl-X1的表达也因此而下调。△ψm下降及Cyto-C的释放导致casp

  ase-3激活，进而诱导了HTLV-1和HTLV-2这两种对大多数凋亡诱导剂有抵抗作用的

  细胞发生凋亡。可见，抑制NF-κB的活性也是砷剂诱导肿瘤细胞凋亡的机制之一。

  2.6　使胞质Ca2＋浓度升高

  Zhang等[18]发现以As2O3处理胃癌细胞系MGC803时，胞质Ca2＋浓度升高与MGC803

  细胞凋亡呈平行关系，且两者对As2O3呈时间、剂量依赖性。推测砷可能通过以下

  机制改变胞质Ca2＋浓度：（1）由于膜表面的Bcl-2相关蛋白具有阳离子选择性通

  道的功能，Bcl-2能在内质网、细胞核和线粒体水平影响Ca2＋的亚细胞分布。因而

  ，砷等凋亡信号对Bcl-2的抑制作用使Ca2＋通道开放，胞质Ca2＋浓度升高；（2）

  细胞内ROS活性升高及砷剂直接作用于细胞内钙离子转位酶的巯基均可使胞内外Ca

  2＋平衡失控；（3）线粒体△ψm下降使得Ca2＋吸收逆转，导致Ca2＋由线粒体转

  移至胞质。内质网及线粒体内Ca2＋耗竭可直接或通过加强线粒体内氧化应激而导

  致细胞凋亡，而且，钙离子本身作为一种凋亡信号，可调节钙离子敏感的关键酶如

  蛋白激酶、磷脂酶、核酸内切酶及谷氨酰氨转移酶等诱导凋亡。

  细胞凋亡与肿瘤的发生、发展是当前研究的热点，探讨砷剂对肿瘤的诱导凋亡作用

  很有意义，将为砷剂应用于临床提供坚实的理论基础。

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