分离链球菌常用的培养基

  作者：朱凤才 杨华富 胡晓杼 汪华 王广和 宋亚军 杨瑞馥

  2000年4月，陕西省岐山县种猪繁育场仔猪流行关节炎和败血症。无菌采取患关节炎猪的关节液和患败血症猪的肝、肺、脾及肠系膜淋巴结各8份病料，并对这16份病料进行病原菌分离试验、血清学鉴定、致病力试验、保护力试验、细菌回收试验、药敏试验。结果表明：该病原菌为2型猪链球菌，引起关节炎的猪链球菌较引起败血症的猪链球菌致病力弱；该菌对头孢菌素、青霉素高度敏感。

  关键词：猪链球菌 分离与鉴定

  论文完成日期：2000年6月15日

  目 录

  摘要………………………………………………1

  前言………………………………………………2

  1. 试验材料……………………………………….2

  2. 方法…………………………………………….2

  2.1病原分离……………………………………..2

  2.2分离菌株的鉴定……………………………..2

  2.3致病力及保护力试验………………………..3

  2.4药敏试验……………………………………..3

  3.结果…………………………………………….4

  3. 1分离菌的培养特性及形态特征….………….4

  3.2生化试验结果………………………………..5

  3.3血清学鉴定结果……………………………..5

  3.4致病力试验及保护力试验结果……………..5

  3.5细菌回收试验结果…………………………..5

  3.6药敏试验结果………………………………..5

  4分析与讨论…………………………………….6

  参考文献…………………………………………7

  猪链球菌的分离与鉴定

  摘 要

  2000年4月，陕西省岐山县种猪繁育场仔猪流行关节炎和败血症。无菌采取患关节炎猪的关节液和患败血症猪的肝、肺、脾及肠系膜淋巴结各8份病料，并对这16份病料进行病原菌分离试验、血清学鉴定、致病力试验、保护力试验、细菌回收试验、药敏试验。结果表明：该病原菌为2型猪链球菌，引起关节炎的猪链球菌较引起败血症的猪链球菌致病力弱；该菌对头孢菌素、青霉素高度敏感。

  关键词：猪链球菌 分离鉴定

  前 言

  猪链球菌（Streptococcosis suis）是猪的一种重要疾病，养猪业发达国家如美、英、荷及爱尔兰等常有本病发生。我国于1958年就有猪链球菌病的报道，1976年我国南方几省曾一度广泛流行，给我国养猪业带来了很大危害。

  猪链球菌截止到目前已发现的荚膜型已超过30种[1]。我国于1995年首例鉴定证实2型猪链球菌在我国的存在 [2]。猪链球菌可致2—6周龄仔猪败血症、脑膜炎、关节炎及支气管肺炎等[3-7]。病猪和带菌猪是本病的重要传染源，病猪的鼻液、尿液、血液、肌肉、内脏和关节内均可检出病原体。未经无害处理的病死猪肉、内脏及废弃物是散播本病的重要原因，呼吸道是本病的主要传播途径。本病一年四季均可发生，但以4—10月份发生较多。本病常为地方性流行性，多呈败血性。短期波及全群，如不进行防治，则发病率、病死率很高，慢性常为地方性散发性传染。

  2000年4月，岐山县种猪繁育场仔猪流行关节炎及败血症，多为2—6周龄仔猪。无菌采取关节炎病猪的关节液及败血症病猪的肝、脾、肺及肠系膜淋巴结，经实验室分离鉴定，证实为2型猪链球菌。现将分离鉴定结果报告如下。

  1． 实验材料

  1． 1病料 无菌采取岐山县种猪繁育场患关节炎病猪的关节液8份，编号为1—8号，无菌采取患败血症猪的肝、肺、脾及肠系膜淋巴结8份，编号为9—16号。

  1． 2试剂 试验所用的各种糖均购自上海化学试剂二厂，批号自95—98年不等。

  1． 3培养基 绵羊鲜血平板、匹克氏增菌液、10ml/L猪血清肉汤及各种糖培养基按常规方法制备[8]。

  1． 4血清学试验 猪链球菌诊断血清与平板凝集抗原均购自中国兽药鉴察所，批号为990705。

  1． 5药敏纸片 购自浙江省军区后勤部，批号20000312。

  1． 6试验动物 健康小白鼠（30—35g）50只，购自第四军医大学实验动物中心。

  2． 方法

  2． 1 病原分离

  将所采病料分别涂片，革兰氏染色镜检，然后，分别接种鲜血琼脂平板。37℃需氧培养24h后，挑取可疑菌落接种于匹克氏增菌液，37℃培养24h后，革兰氏染色，显微镜检查，再接种血清肉汤，纯化后放置4℃，冷藏备用。

  2．2 分离菌株的鉴定

  2．2．1生化试验

  随机抽取上述分离菌血清肉汤培养物3#、8#、13#、15#，分别接种于蔗糖、山梨醇、棉实糖、葡萄糖、甘露糖、蕈糖、乳糖、菊糖、水杨苷、马尿酸钠培养基，37℃培养24h后，观察其对糖的利用情况。

  2．2．2血清学鉴定

  将3#、8#、13#、15#菌经缓冲肉汤培养8h，通过3000r/min离心10min，PBS洗涤2次，用Ph7.2 的0.01mol/L PBS制成 1*10 10~2*10 10细菌悬液。取1滴上述细菌悬液与适当的抗血清在洁净玻片上混匀，立即观察凝集现象。同时，设立细菌悬液对照及血清对照。

  2．3 致病力及保护力试验

  2．3．1菌落形成单位的测定 按常规方法进行[9]

  2．3．2致病力试验

  无菌吸取上述血清肉汤培养物 （含菌量5.0*10 8CFU/ml）以0.1ml /只、0.2ml/只、 0.3ml/只、 0.4ml /只、0.5ml/只分别腹腔注射小白鼠2只，观察其死亡时间和数量，测定其最小致死量。再将上述血清肉汤培养物腹腔注射小白鼠，小白鼠共14只，分7 组。第一组，每只小白鼠注射3#菌0.2ml，第二组每只注射8#菌0.2ml，第三组每只注射3#、8#菌各0.1ml，第四组每只注射13#菌0.2ml，第五组每只注射15#菌0.2ml，第六组每只注射13#、15#菌各0.1ml，第七组每只注射无菌血清肉汤1.0ml。以上各组分别饲养观察其死亡时间及数量。

  2．3．3保护力试验

  将3#、8#、13#、15#血清肉汤培养物分别接种于18 cm鲜血平板。37℃培养24h后，收菌，用麦氏比浊管比浊，适当稀释，然后用0.3%甲醛灭活；37℃作用24h；作无菌检验。然后分别腹部皮下接种小白鼠2只，0.4ml/ 只。10天后，再分别人工感染，0.2ml/只。

  2．3．4细菌回收试验

  对致病力试验出现症状及死亡小白鼠剖检，并采集病料，进行分离。

  2．4药敏试验

  采用纸片扩散法，用无菌棉签蘸取分离菌的血清肉汤培养物，均匀涂布于9cm鲜血平板；待稍干后，用无菌镊子将各种药敏纸片分别平贴在培养基表面，4℃2h使药物扩散，然后置37℃培养20—24h，观察结果。结果按抑菌圈直径大小和各抗菌药的具体标准，评定为高度敏感、中度敏感或耐药。结果评定参照表1。

  表 1 各种抗菌药物的抑菌圈与敏感标准

  抗菌药物名称

  抑菌圈直径（mm）

  耐药

  中度敏感

  高度敏感

  青霉素

  土霉素

  洁霉素

  链霉素

  庆大霉素

  卡那霉素

  头孢菌素

  <10

  <10

  <10

  <10

  <12

  <12

  <10

  10~12

  10~14

  10~14

  10~14

  13~14

  13~14

  10~15

  >13

  >15

  >15

  >15

  >15

  >15

  >15

  3．结果

  3．1分离细菌的培养特性及形态特征

  3．1．1培养特性

  37℃培养24h后，所采的12份病料在鲜血琼脂平板上形成表面光滑、隆起的灰绿色小菌落，外层有明显的β溶血环。该菌在匹克氏增菌液中底部有沉淀，在血清肉汤中先均匀浑浊，后在试管底部形成沉淀，上部澄清，不形成菌膜。

  3．1．2染色特性

  关节液、鲜血琼脂、匹克氏增菌液及血清肉汤培养物涂片、革兰氏染色、显微镜检查为革兰氏阳性，在关节液、鲜血琼脂培养物中多呈单个、双球或短链状排列，在匹克氏增菌液及血清肉汤培养物中多呈长链状。

  3．2生化试验结果（见表2）

  表2 分离菌生化试验结果

  鉴定 蔗糖 山梨 棉实 葡萄 甘露 蕈糖 乳糖 菊糖 水杨 马尿

  项目 醇 糖 糖 糖 苷 酸钠

  3# + - - + + + + + + -

  8# + - - + + + + + + -

  13# + - - + + + + + + -

  15# + - - + + + + + + -

  判定标准：“+”表示大多数（90%—100%）菌株为阳性；“-”表示大多数（90%—100%）菌株为阴性。

  表2表明分离的3#、8#、13#、15#菌的生化反应结果均符合猪链球菌的生化特性，说明分离的菌均为猪链球菌。

  3．3 血清学鉴定结果

  将3#、8#、13#、15#细菌悬液与1/2及2型抗血清混合，立即可见明显的凝集现象，但不与1型及其他型抗血清出现凝集。直接挑取细菌菌落与血清混匀，也能得到一致结果。阴性对照均未见凝集现象。

  3．4 致病力试验结果及保护力试验结果

  3．4．1致病力试验结果

  第一组、第二组小白鼠注射血清肉汤培养物48h内均未见死亡，第三组48h内有一只死亡，第四组、第五组、第六组在注射血清肉汤培养物18h内全部死亡。死亡后，小白鼠皮肤发绀，剖检肝、脾、肺、心出血，呈败血症。第七组健活。由于第一、二、三组死亡数量非常少，所以，再用相同剂量分别背部皮下接种小白鼠各2只，48h后处死，剖检发现注射部位有直径0.9~1.1cm的脓肿，浓汁呈黄绿色。

  3．4．2保护力试验结果 免疫的小白鼠再经攻毒后均未发病。

  3．5细菌回收试验结果

  将上述死亡及发病的小白鼠剖检采集病料，进行细菌分离、生化试验及血清学鉴定，能得到原分离菌。

  3．6药敏试验结果（见表3）

  表3 药敏试验结果

  菌号

  抑菌环直径（mm）

  头孢菌素 青霉素 洁霉素 卡那霉素 土霉素 链霉素 庆大霉素

  3# 19 15 14 13 8 7 7

  8# 18 16 13 13 8 6 7

  13# 19 16 14 13 7 7 8

  15# 19 15 13 14 8 8 8

  平均值 18.75 15.5 13.5 13.25 7.75 7.0 7.5

  表3表明，结果敏感的药物依次是：头孢菌素、青霉素；中度敏感的依次是：洁霉素和卡那霉素；而对土霉素、链霉素、庆大霉素具有抗药性。

  4．分析与讨论

  4．1 猪链球菌（Streptoccus suts）是危害养猪业的一种重要病原菌。80年代初，加拿大由猪链球菌引起的疾病开始增加。那时仅检出9种夹膜血清型，其中2型是最常见的。

  4．2 猪链球菌病在临床上有败血型、脑膜脑炎型、关节炎型支气管炎型等。过去屡有败血型猪链球菌的报道，而关于集约化养猪场关节炎型链球菌病的报道较少。本次试验从患关节炎猪的关节液中成功的分离出了猪链球菌。另外，岐山种猪场，约有60%的仔猪流行关节炎，严重者可发生败血症而死亡，给种猪场造成巨大的经济损失。所以，研究本病可为生产中防制本病提供理论依据。

  4．3 病猪和带菌猪是本病的重要传染源。病猪的鼻液、尿液、肌肉、内脏和关节内均带有病原体，所以，我们建议，首先应加强对健康猪的免疫。另一方面，在发病后，加强病猪和健康猪的隔离，根据实验室所做的药敏试验结果，配合药物治疗，建议用头孢菌素、青霉素、洁霉素等药物治疗。岐山县种猪繁育场采纳我们的建议后，首先对所有的未发病仔猪用灭活疫苗免疫接种，对已发病的猪用青霉素等药物配合治疗。另外，注意卫生管理。目前该病已得到有效的控制。

  4．4 从致病力试验结果可以看出，引起猪关节炎的猪链球菌的致病力较小，而引起败血症的猪链球菌的致病力较强。但通过生化试验和血清学鉴定，它们又是同种细菌且血清型也相同。为什么同种血清型的猪链球菌的致病力差别很大？这个问题还有待于进一步研究。

  参考文献

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  [1] 杨本升，刘玉斌，苟仕金等． 动物微生物学． 吉林科学技术出版社，1995

  [2] 张庚华．猪链球菌感染最新研究进展．国外兽医学—畜禽疾病，1995，16（2）：31

  [3] 黄毓茂,黄引贤．2型猪链球菌的血清学鉴定．中国兽医学报，1995，15（1）：63—65

  [4] Gottschalk M.J Clin Microbiol，1989，27：2633—2636

  [5] Higgins R et al．Can J vet Res，1990，54：170—173

  [6] Sanford S E.JAVMA，1982，181：673—676

  [7] Wiadsor.Vet Rec，1977，101：378—379

  [8] 李健强. 兽医微生物学实验与实习指导．西北农业大学，1996

  [9] 张彦明，贾靖国，刘安典．动物性食品卫生检验技术．西北大学出版社，1996

  [10] 蔡宝祥．家畜传染病学．北京，中国农业出版社，1998

  [11] 甘肃农业大学主编，兽医微生物学．北京，中国农业出版社，1982

  [12] 刘荣标．兽医微生物学（上）．台北，艺轩图书出版社，中华民中73 年

  [13] 郑明球．家畜传染病学实验指导．北京， 中国农业出版社，1999

  [14] 甘肃农业大学主编．兽医微生物学（第二版）．中国农业出版社，1998

  [15] 郝天斌，陈雨田．猪非溶血性关节炎型链球菌病的诊治．中国兽医科技．1999，29（3）：34—35

  [16] 陈书琨，林庆燕．猪链球菌生化突变株的分离与鉴定

  [17] 汪诚天，叶祝年，一支方等．兽医实验手册．上海科学技术出版社，1984