35年狼疮性肾炎临床与基础研究

  摘要　本研究在国内首次发现异常增高的循环白介素-6可导致狼疮性全身性病理损害；白介素-6异常增高在狼疮性小管间质损害过程中可能具有重要作用；白介素-6及其信息传递中的GP130,JunB基因异常表达参与了弥漫性增生性狼疮性肾炎(LN)分子发病过程，并率先发现丹参通过增强c-myc蛋白高水平表达而诱导细胞凋亡，从而对人肾成纤维细胞增殖产生抑制作用。在国内外首次证实巨噬细胞在LN的病人肾脏局部增殖，且和疾病严重程度呈正相关。首次发现白介素受体(sIL-2R)和FLCT增多是诊断早期活动LN的可靠指标。筛选并建立了一种本病活动性的计分方法；发现小管间质病变分级对LN肾小球病理、临床表现、治疗、疗效及复发的判断均有指导意义。在国内首先报道超大剂激素冲击疗法治疗严重的活动性LN，率先提出适合我国国情的改进CTX冲击疗法治疗LN。发现中药在促进骨髓造血，对抗CTX等致免疫功能过度抑制具有一定作用。首次在国内探讨了LN尿毒症的可逆性，并分析发现SLE死亡最主要原因并非尿毒症。

  狼疮性肾炎(LN)是一种临床常见的自身免疫性疾病，严重影响着人民的健康。由于其诊断治疗较为棘手，发病机制仍不明确，因此LN的研究一直受到国内外学者的重视［1～9］，我们课题组对此病作了30多年的临床和实验研究，于1963年在国内最早分析了当时国内最大组别的系统性红斑狼疮(SLE)［10］，以后不断地进行临床观察和研究。近年来随着细胞分子生物学技术的发展，我们对其分子发病机理与临床进行了综合研究，现总结如下。

  1　发病机理

  1.1　白细胞介素-6

  白细胞介素-6(白介素-6)与LN发病机理仍然尚不十分清楚，为了确定LN病人体内是否存在内源性白介素-6表达增高及其来源，我们应用ELISA法检测58例LN病人的血清及外周血单个核细胞(PBMC)内白介素-6蛋白的水平［11］，在国内首次采用原位杂交方法结合IBAS 2.0图像分析系统，检测其中20例LN病人PBMC在未受任何刺激时白介素-6 mRNA表达强度，并分析3者之间的关系。结果表明该3者水平在LN病人体内均异常增高，活动期尤其明显，3者之间互呈直线正相关。提示LN病人PBMC内源性过度表达和合成白介素-6是其外周白介素-6水平增高的原因之一，异常增高的循环白介素-6对狼疮性全身性病理损害，尤其对肾损害具有重要的作用，同时证明血清白介素-6增高可提示LN处于活动期，对临床指导治疗有一定意义。另外，我们探讨了白介素-6在狼疮性小管间质病变中的作用［12］，通过检测42例活动期LN患者尿白介素-6水平与其中的15例肾小管间质白介素-6 mRNA水平，发现42例活动期LN患者中有36例尿白介素-6肌酐比值＞5 ng/mg，其增高程度与尿微球蛋白(β2-MG)及NAG酶活性水平呈显著正相关；在15例肾组织切片中，肾小管间质均有白介素-6 mRNA表达，小管间质病变愈严重，其表达量愈高，而健康肾组织小管间质几乎无白介素-6 mRNA表达。提示LN患者活动期尿白介素-6水平异常增高与肾小管间质白介素-6 mRNA异常表达有关，白介素-6在狼疮性小管间质损害过程中可能具有重要作用。

  有关白介素-6信号传递系统中GP130和JunB是否参与了弥漫性增生性LN的分子病理过程目前国内外尚无报道。我们采用原位杂交技术观察了20例弥漫性增生性LN患者肾活检组织肾小球细胞中白介素-6、GP130和JunB mRNA表达，并分析其与患者肾小球系膜区增宽和尿蛋白之间的关系［13］，结果在国内外首次发现弥漫性增生性LN患者白介素-6、GP130 JunB基因mRNA表达分别是6.6±0.9，8.6±0.9和6.7±0.8，较对照组明显增加(P＜0.01)；白介素-6、GP130 mRNA表达与系膜区增宽和尿蛋白排泄量呈正相关。提示白介素-6及其信息传递中的GP130和JunB基因异常表达在弥漫性增生性分子发病机理中起一定作用，为LN的分子病理机制提供了新的实验依据。

  1.2　细胞凋亡

  近年来，细胞凋亡理论的引入为LN发病机制的研究开拓了一个新的领域。LN与细胞凋亡之间具有密切的相关性［14］。我们率先在国内成功分离培养LN患者肾活检组织的成纤维细胞，探索环磷酰胺能否通过诱导细胞凋亡来减轻纤维化病变，观察环磷酰胺衍生物4-氢过氧环磷酰胺(4-hydroperoxycyclophosphamide,4-HC)对LN患者肾间质成纤维细胞凋亡的影响［15］，结果发现4-HC可明显促进其凋亡，这为临床应用环磷酰胺治疗LN、减轻肾间质纤维化和延缓肾功能恶化，提供新的实验证据。另外检测了丹参(ρ=10 g/L或20 g/L)对人肾成纤维细胞氚标记胸苷(3H-TdR)掺入率的影响，并用流式细胞仪检测细胞的程序性死亡(programmed cell death)即凋亡(apoptosis)［16］，结果显示：丹参对人肾成纤维细胞增殖有抑制作用，且呈剂量依赖性。流式细胞仪检测程序性细胞死亡结果表明，丹参可促使人肾成纤维细胞发生程序性死亡，呈剂量依赖性。丹参通过使c-myc蛋白高水平表达而诱导细胞凋亡，从而对人肾成纤维细胞增殖有抑制作用。

  1.3　巨噬细胞

  巨噬细胞的局部增殖在LN发病机制中的作用尚无人报道［17］。在LN性肾炎的肾病理组织切片中发现许多巨噬细胞，传统观点认为肾脏中的巨噬细胞来源于血液的单核细胞，这些巨噬细胞在肾组织中不再增殖。我们的研究在世界上首先发现巨噬细胞在LN病人肾脏局部增殖，其增殖程度和疾病严重程度呈正相关，例如在Ⅳ型LN，增殖的巨噬细胞明显多于Ⅱ型LN［18，19］。提示巨噬细胞局部增殖在LN的致病中起重要的作用，同时也为寻找新的治疗手段提供了新线索。由于巨噬细胞局部增殖使炎症反应放大，如能抑制巨噬细胞的局部增殖，使能有效地抑制疾病的进展［20］。

  2　临床研究

  2.1　临床表现与病理

  临床上我们对LN特点进行了全面和系统的临床观察，包括对老年LN［21］、儿童LN［22］和SLE临床免疫学特征［23］进行了研究。发现LN仍以女性为主，但临床免疫学特征也有差异。通过对66例男性和463例女性患者临床特点的比较，发现男女之比为1∶7，男性出现肾损害的间隔时间短于女性(P＜0.05)，以肾损害为首发症状者较女性多见(P＜0.05)；男性脾肿大、盘状红斑等症状高于女性(P＜0.05)，但关节痛、蝶形红斑等低于女性(P＜0.05)；男性死亡率Ⅴ型LN发病率高于女性［24］。另外对152例LN的呼吸系统临床表现［25］、系统性红斑狼疮(SLE)肺胸膜病变［26］和LN并肾性尿崩症［27］也进行了观察研究。对SLE患者心脏病变也进行了研究［28］，结果发现有超声心动图异常的79例(61.24%)，其中瓣膜异常52例，心包积液36例，心肌异常24例，兼有不同程度的瓣膜、心肌或心包病变者34例，有抗磷脂抗体的患者心瓣膜损害的发病率较高(67.3%)，提示这种抗体在SLE患者心瓣膜病变的发病机制中可能有促进作用。我们曾报道了SLE的临床免疫学特征，例如抗Rib-P是诊断SLE的重要指标，但我们首次发现抗Rib-P阳性和阴性组肾损害无明显的差别，它与SLE神经系统损害和关节炎等关系密切［29］，通过对130例与160例LN免疫血清指标进行观察［30］，结果进一步证实：①抗Sm抗体与疾病活跃程度相关，可作为判断病情、监测疗效的血清学指标；②抗Sm抗体阳性常伴内脏病变、皮肤损害严重，易脱发；③抗Sm抗体为标记性抗体，对SLE诊断特异性很高，此与国内外报道相似。我们也报告了经肾活检诊断的75例LN，分析了其临床、实验室和病理检查资料［31］，结果病理类型以弥漫增生型最多，活动性指数的病理积分也以该型最高，此与国内外的认识一致。另外对系统性红斑狼疮的误诊进行了分析［32］，这些观察极大地丰富了LN肾外临床表现的研究内容，补充了SLE的临床研究的某些空白点。

  2.2　活动指标

  LN活动指征的判定对诊治本病具有非常重要的意义。为了寻找更加准确合理地评估SLE(LN)活动的客观指征，我们在国内首次对30例LN患者尿中内白介素-2受体(IL-2R)和免疫球蛋白自由轻链(FLCT)进行了观察，结果发现sIL-2R和FLCT增多是诊断活动LN早期可靠指标［33～35］，研究了尿白介素-6检测在SLE病情判断中的价值［36］，结果发现各型LN患者尿白介素-6水平均明显升高，其中隐匿型尿白介素-6水平已有明显升高，肾功能不全型尿白介素-6水平显著高于隐匿型、肾炎型或肾病综合征型。活动期LN患者尿白介素-6水平显著高于非活动期，经治疗后明显降低，复发时重新升高。WHO Ⅳ型LN患者尿白介素-6水平明显高于其他病理类型。此外，尿白介素-6水平与血清白介素-6水平不相关，但与抗dsDNA抗体相关。因此提示尿白介素-6检测可作为LN早期诊断、活动性监测、疗效及复发判断的非创伤性生化指标之一，并可部分替代肾活检。另外我们观察了LN活动期和环磷酰胺(CTX)加激素冲击治疗后8周患者晨尿白介素-8水平的变化［37］，以治疗稳定期的LN患者作对照，发现LN活动期患者尿白介素-8水平显著高于稳定期LN患者；CTX加激素治疗8周后的白介素-8水平显著低于治疗前，狼疮活动的临床症状和生化指标明显好转，提示尿白介素-8水平与LN的病变活动密切相关，并可作为LN活动和预后评估的一个重要参数。在国内首次以临床医师的判断作为疾病活动程度的外部标准，对117例LN患者的资料进行单因素相关分析和多元回归分析，筛选出了与LN疾病活动程度相关性最好的临床与实验室指标，并建立了一种疾病活动性的计分方法［38］。结果筛选出14个最能提示疾病活动性的参数，并以各参数在多元回归分析中的回归系数作为其各自的加权分(略加简化)，建立的这种LN疾病活动程度的计分方法，即活动性指数，它能较简便、合理、有效地测定LN的活动程度。我们也探讨了经肾活检的75例LN，并分析了其临床、实验室和病理检查资料［39］。全部病例的肾活检结果均有肾脏的免疫病理学及组织病理学异常。病理类型以弥漫增生型最多，活动性指数的病理积分也以该型最高。LN的临床表现、实验室检查与病理类型有一定的相关性，通过观察不同病理类型LN的肾损害表现及实验室特点，提出了根据LN临床表现和实验室检查结果，可以大致推测其病理类型，估计肾损害的严重程度，以指导治疗，判断预后。对LN患者肾小管间质病变(TIL)病理分级与临床的关系也进行了研究［40］，发现活动性LN中TIL发生率高，小管功能改变较早，发生率相对较高。提示小管间质病变分级对LN肾小球病理、临床表现、治疗、疗效及复发的判断均有指导意义。

  2.3　治　疗

  以前肾上腺皮质激素一直是治疗的主要方法。我们在国内较早系统地介绍并应用此类方法治疗LN［41～47］。曾于1983年首次报道超大剂量激素冲击疗法治疗严重的活动性LN 6例［48］，疗效满意，即采用甲泼尼龙1 g/d或地塞米松150 mg/d，加入50 g/L葡萄糖液300 mL中静脉滴注，每d 1次，3 d为1疗程。然后口服泼尼松40～60 mg/d，4周后逐渐减量，至维持量，必要时，隔2周可重复使用冲击疗法。1991年我们率先提出LN治疗上的新概念，应着重使用环磷酰胺，在国内外首创适合我国国情的改进CTX冲击疗法治疗LN［49，50］，在急、重症LN治疗的初期，静脉注射CTX以每2周1次，每次8～12 mg/kg，连用2 d，有利于及时缓解病情，提高疗效，治疗后病情减轻时改为每月1次，如果狼疮活动基本控制后应以每3个月1次，以巩固疗效，这些研究结果已广泛的被国内同行认同和采用，部分内容已成为国内目前治疗本病的常规方法。并首次报道环磷酰胺大剂量冲击治疗LN并发狼疮脑炎见效快，副作用少，优于以往的激素疗法［51］，同时报道了狼疮性肾炎所致肾病综合症的治疗［52］，最近我们探讨了不同活动程度的重症LN患者使用环磷酰胺冲击治疗的最佳间期与合理剂量［53］，也研究了小剂量环孢霉素A(CsA)与环磷酰胺(CTX)治疗比较，结果两者总体疗效相当［54］。LN所致的尿毒症，过去一直认为是不可逆转而放弃治疗，仅以透析维持生命，我们在国内率先介绍了狼疮性肾炎尿毒症的新疗法［55］并报道了狼疮性肾炎尿毒症的可逆性的研究，以激素和环磷酰胺治疗17例透析中的LN患者，16例获得成功［56］。我们研究发现在下列情况：尿毒症早期(病史小于2年，影像学检查双肾未缩小，肾功能急剧恶化，有狼疮活动者)的病人，在腹膜透析的基础上，可用标准激素疗法及环磷酰胺(CTX)治疗。另外我们研究发现在腹膜透析或血液透析辅助治疗下激素和细胞毒性药物(环磷酰胺)对狼疮肾炎(LN)尿毒症的逆转具有重要作用，但腹膜透析组的疗效明显优于血液透析组［57］，其原因可能与腹膜透析的特点有关，腹膜透析是一种接近生理状态的透析方法，能保护残存肾功能［58］，提示有LN尿毒症者应尽可能选择腹透作辅助治疗。

  中西医结合治疗LN是我们临床研究的重要内容之一，我们的成果受到国内外学者的重视和引用［59，60］。我们较早介绍并应用了中医及中西医结合治疗LN，提出进一步开展中西医有机地结合治疗LN的研究［3，61～63］，为我国中西医结合研究本病提供了新的思路；并较早开展了系列研究，包括中西医结合治疗重症LN［64］、LN急进型［65］和LN并发带状疱疹［66］。通过对LN采用中西结合方法治疗并与单纯用西药治疗进行对照观察，结果显示中西结合治疗组的总有效率高于对照组［67］，初步显示中西医结合组在提高疗效、减少复发和减少副作用方面，均优于西医组［68］；首次发现中药在促进骨髓造血［69］、对抗CTX等致免疫功能过度抑制具有一定作用［70］。对LN尿毒症研究方面，显示在腹膜透析下用中西医结合方法治疗较单纯采用西医治疗的效果好［71］。

  2.4　预后

  对LN预后也作了较深入系统的研究，例如采用非参数乘积限估计法分析生存率COX模型分析预后因素，调查了588例患者的长期存活率并分析影响存活率的预后因素，结果LN病人1、5、10、13年存活率分别为88.0%、74.2%、59.1%及53.4%。影响生存的因素有血清肌酐≥12 μmol/L，尿细胞管型，系统性红斑狼疮活动指数(SLEDAI)≥20分，年龄≤15岁，合并感染及肾脏病理WHO分型Ⅳ型，其中，血清肌酐升高及狼疮活动指数≥20分是独立的预后影响因素，激素加环磷酰胺治疗能提高存活率［72］，提示肾脏受损及狼疮活动程度是影响LN预后的重要因素，积极的免疫抑制治疗有利于改善预后。这是目前国内最大的病例样本数和观察时间最长的病例。

  另外我们对465例SLE患者中的90例死者死因进行分析［73］，结果最主要死因是SLE本身40例(44.44%)，其次是感染30例(33.33%)，心血管疾病12例(13.33%)，SLE与感染致死较常发生于年轻患者，SLE死亡多发生在诊断后的头3年，SLE死亡最主要原因是SLE本身。故对SLE活动应积极治疗，但不能过度，以免引发感染而死亡。

  我们首次在国内探讨了LN尿毒症的可逆性［74］，在15年中37例已开始进行透析的LN患者，予以积极的激素和CTX治疗，结果83.8%的患者脱离了透析，停止透析平均时间为(40.6±21.5)个月，停止透析半年以上的血肌酐值平均为(179.36±88.24)μmol/L。提示需要透析的LN患者，并不等于终末期肾病；在有适应症时，经积极治疗，肾衰有逆转的可能［75］。以往认为LN死亡的主要的原因是尿毒症，我们通过对586例LN中死亡的119例进行死因分析，发现各器官受累的常见程度依次为肾、脑、肺、肝，主要原因并非为尿毒症［76］，这些研究对改善本病的预后，正确判断预后具有一定的重要作用。