HBV基因定量分析技术的应用价值、存在问题及展望--HBV基因定量分析技术的应用价值

  作者：缪晓辉 孔宪涛

  近年来HBV基因定量分析的价值受到越来越多研究者的重视[1]。过去由于过分强调了HBV感染后过强的细胞免疫应答介导肝细胞损伤，忽视了对病毒复制水平与致病性之间因果关系的研究。目前普遍认为，尽管HBV不直接破坏寄生细胞，但病毒的活跃复制是启动或激发肝脏组织炎症反应的因素。这表明确定感染者体内HBV复制状态，即从HBV基因定量的角度作病情分析是十分有意义的。事实上，真正引起人们关注HBV基因定量分析价值的重要原因是最近发现了干扰素治疗与HBV基因水平两者之间有非常密切的关系。HBV基因定量分析还在转基因动物、基因治疗、蛋白疫苗和核酸疫苗、抗HBV药物体外试验和动物试验及耐药研究、流行病学研究、HBV血液制品污染监测等方面具有重要的应用价值。

  一、HBV基因定量分析在干扰素治疗中的应用

  尚无药物可以清除所有HBV感染者体内HBV颗粒。干扰素是目前唯一有一定疗效的一类生物制剂[2],它在病毒等诱导下由几种相关细胞产生，并发挥抗病毒作用。但是无论使用何种干扰素，也无论治疗剂量或疗程如何，干扰素治疗后HBV转阴率迄今仍保持在40%左右，无法进一步提高，究竟有哪些制约因素起作用尚无定论。

  近年来发现干扰素的治疗效果，即干扰素治疗后的反应性(response)很大程度上取决于HBV在体内的复制水平[2,3]。以下几点事实值得注意:⑴治疗前HBV低水平复制者的反应性明显优于高水平复制者。HBV转阴的几乎都是那些治疗前血清HBV DNA含量较低者，而治疗前HBV DNA含量特别高者大多没有疗效；⑵治疗中病毒复制水平迅速降低者，有望治愈。相反，治疗期间HBV基因水平下降较慢，或下降幅度较小，或变化不明显者，大多是无效者；⑶治疗结束后，采用PCR定量法检测，HBV DNA完全转阴者可能不再复发，而终止治疗后HBV DNA仍保持较低水平者，反跳的可能性较大。可见，使用干扰素治疗HBV感染时，在各种近期和远期疗效指标中，除了病人的临床表现是否好转，生化指标(ALT)是否改善，肝组织炎症反应是否减轻等以外，血清HBV DNA定量分析是一个十分重要的观察项目。从现有研究资料看，除病理检查外，HBV DNA定量检测，也许是干扰素治疗效果判断依据中最直接、最可靠和最有价值的指标。多数研究者认为，通过HBV DNA定量分析来指导干扰素治疗，有重大意义。首先，在治疗对象的选择方面，即确定干扰素治疗适应症时，应对各侯选病例在某个时间段内定期反复检? 釮BV DNA水平，那些长期保持HBV高复制水平者不宜接受干扰并素治疗，或应当联合治疗；其次，干扰素治疗期间，可根据HBV基因水平的动态变化适时调整治疗剂量，决定是否缩短或延长疗程，及是否终止治疗。这不仅对制订合理的治疗方案，也对减轻病人负担，避免不恰当用药有指导意义[4]。笔者认为，目前国际上普遍采用的所谓“六个月疗程”及某些中高剂量治疗方案均缺乏充分和足够的立论依据，有必要结合基因定量分析结果，重新评价和制订干扰素治疗计划；最后，干扰素治疗结束后，对有反应者定期作定量分析，有助于发现复发者，并根据血清HBV DNA含量波动情况决定是否实施再治疗。有人报告，首次干扰素治疗有效者，再治疗的效果亦佳。如果第一次治疗无反应或反应较差者，第二次干扰素治疗仍不能取得理想疗效[5]。

  二、HBV基因定量分析的其他临床价值

  HBV感染后，在临床表现方面的差异非常明显,可以表现为无症状携带者、急性肝炎、慢性肝炎、暴发型肝炎、肝硬化及肝癌等多种疾病状态。病毒在肝细胞内的复制水平与各种临床疾病状态之间可能存在着某些必然联系。由于HBV基因定量技术的发展和成熟，目前已有可能从某些现象上阐明HBV复制与致病性之间的“量效”关系。

  ㈠“无症状携带者”可能为活动性乙肝患者[6]。有部分HBV感染者，由于免疫耐受或其它原因，体内HBV呈复制不活跃的“潜伏”状态，但并不意味着不存在进行性肝损害。Mels等研究发现无症状携带者在其自然发展史上，HBV复制处于波动状态，时有加剧，病毒复制积累到一定程度后ALT水平增加。一般规律是:血清HBV DNA水平上升® ALT活性增加® IgM抗HBc滴度提高。因此无症状携带者应采取积极治疗措施，否则这类人群不仅作为重要的病毒库传播HBV，而且由于隐匿性肝细胞损伤的不断积累，不经过慢性肝炎阶段，直接向肝硬化和肝癌发展。

  ㈡HBV DNA水平与HBV感染者病情和预后的关系密切。上述无症状携带者是一个特殊群体。而对那些急性和慢性乙型肝炎患者而言，HBV DNA水平对预后判断有帮助。研究发现HBV DNA一直保持较高水平的急性肝炎患者易慢性化，而HBV复制水平较高的慢性肝炎患者不仅对干扰素治疗的反应性差，而且肝组织炎症反应更明显，病情更重，更易发生肝硬化和肝癌。目前在能否用血清HBV DNA水平来判断肝组织炎症损伤程度这类问题上尚有争议。动物实验表明，鸭肝被DHBV广泛感染的同时，并不伴随明显病毒血症,肝细胞清除病毒的同时也无病毒血症加重的证据[7]。然而最近有人对HCV感染者进行基因定量分析研究，发现HCV RNA水平与ALT水平以及肝脏knodell分级之间有密切关系[8]。

  ㈢肝移植者HBV DNA定量的意义

  Mazzaferro等报告肝移植前患者血清HBV DNA水平的高低决定移植后肝脏是否再感染HBV[9]。作者观察到，14例移植前血清HBV DNA含量低于103拷贝/ml，移植后不间断地采用HBsAb免疫预防，随访36个月，无一例再发肝炎，但另外两例移植前病毒拷贝数大于105/ml则发生了严重HBV再感染。建议移植前使用抗HBV药物，最大限度降低血清HBV DNA浓度，有助于防止HBV侵犯移植后肝脏，提高肝脏移植的效果。

  ㈣前核基因突变HBV定量意义

  HBV前核基因突变可导致HBeAg表达缺失。感染不表达HBeAg的HBV突变株，或野生型HBV在体内突变并成为优势株均产生较严重的后果，如易发生暴发性肝炎，预后差，干扰素治疗无效等[9,10]。目前已能采用核酸序列测定技术、PCR技术、限制性片段长度多态性(RFLP)分析技术等来定性检测HBV前核基因突变。最近Baxall建立了一种PCR及产物的显色反应点突变分析技术(Colourimetric point mutation assay)，用来定量分析突变前核基因，有助于进一步探讨HBV突变与致病性之间的关系[11]。

  基因定量分析是一项临床应用型技术，但对基础研究也有一定的应用价值[12]，尤其是在当前基因治疗、转基因动物、核酸疫苗等热点研究领域，基因定量分析可能是一种很好的辅助手段，对发现一些有意义的现象也许有一定帮助。比如HBV在转基因小鼠组织脏器分布规律可用定量标准来衡量，以及用定量手段观察各种药物、细胞因子和其它物质对转基因小鼠HBV基因复制的调节作用。又如对核酸疫苗注入肌组织后的各种动力学变化的研究远未深入，如能采用定量手段，分析抗原表达基因在体内的存在状态无疑是有益的。至于各种抗HBV药物，无论是在体外细胞模型(包括转基因细胞模型)还是在动物模型的研究，或在人体研究，采用基因定量分析，应当是考核药物疗效的最佳手段[13]。

  HBV因定量分析存在的问题及未来展望

  HBV基因定量技术的发展历史不长，但由于有定性技术为基础，以及与其它学科方法的融汇，发展速度很快，目前趋于成熟。但应用定量技术去研究HBV感染的临床问题还不充分，同时定量技术本身也有许多问题值得探讨。

  一、国际标准化。这是一个最为突出而又必须尽快解决的问题。欧洲有一个“病毒性肝炎研究组”（European Study Group in Viral Hepatitis)，经常向欧洲的某些研究机构提供HBV血浆标准品作定量分析参考[14]。有必要在国际上设立统一的HBV基因标准品，包括各种HBV亚型的标准参照。笔者认为，克隆的HBV DNA质粒不适宜作标准品。克隆HBV DNA与载体构成了闭环超螺旋结构，而且，一级结构单一，这与体内存在的HBV基因结构差异很大。后者呈部分双链，在血清中尚有裂解片段及复制中间体等形式。因此，无论是在分子杂交，还是在PCR过程中，质粒HBV DNA结构与人体内感染的HBV DNA结构在杂交效率或扩增效率上必然有细微差别，结果将影响定量分析的准确性。如从高水平HBV阳性病人血清大量抽提，或从转基动物血液中纯化得到HBV DNA，可能是一个制备标准品的途径。总之，国际化的标准参照，是保证HBV DNA定量技术精确性和可靠性的前提。

  二、分子杂交定量技术和PCR定量技术应当共存下去吗? 以下两点值得考虑:首先，有必要弄清体内HBV复制水平极低者(如低于1fg/ml)占HBV感染人数的比例有多大？这类低水平复制者预后如何?如果这类人群属于急性感染恢复期，或有自然清除病毒倾向者，那么似无必要作常规PCR定量分析，定期进行PCR定性检测即可。其次，有必要建立一种敏感度介于分子杂交和PCR定量技术之间的检测系统。最近有人利用电化学技术观察到DNA双链互补杂交，甚至单个碱基对结合时发生了微电反应，这给我们以很大启示，今后如有可能在这方面打开突破口，那么基因定量分析两大技术共存的局面会发生转变。但是，在目前这两大技术仍有很强的互补性。

  三、HBV突变株定量分析意义的研究。HBV基因突变[15]，尤其是前核基因突变，直接影响HBV感染病情转归及抗毒治疗效果，同时也反映了来自体内或外界选择压力的作用。因此，突变株在体内产生的确切原因，突变株与野生株混合存在的发展趋向，突变株是否为耐药株，突变株与野生株相对含量的变化与致病性的关系，突变株与免疫耐受的关系等均是有必要进一步澄清的问题。

  四、基因定量技术在HBV感染流行病学方面的应用[16]。HBV经血液传播致病已十分明确，但是体液传播的问题还必须有充足的证据来补充。体液及其它分泌液或排泄物传播HBV是日常生活密切接后感染HBV的直接原因，但其中必然存在“含量与传染性”的关系，那么这个致病的量值完全可以通过HBV感染流行病学研究得到确证。另外，被污染血制品中HBV基因含量与使用血制品后感染HBV的危险性之间的关系也值得研究。

  五、加强HBV低水平复制者预后研究。目前看来，所谓健康携带者或无症状带病毒者、干扰素治疗部分反应者(partial responders),以及其他种种HBV在体内呈低复制状态者，在病情、机体免疫状态、预后等方面可能都有一些特殊性，这类病人是否有自然清除病毒的倾向，是否应当实施抗病毒治疗，是否成为重要的传染源等问题都应该作出符合实际的回答。

  六、HBV复制水平与抗病毒药物疗效之间的关系研究有待深入。笔者认为，HBV DNA水平与干扰素治疗效果之间的所谓联系在理论上缺乏根据，可能是一种表面现象，有必要探讨其本质。病毒复制水平高低取决于病毒自身的生物活性和机体的免疫功能，应当从病毒和机体两方面寻找突破口，提高干扰素抗HBV的效果。

  最后，在中国，有世界上为数最众的HBV感染及相关慢性肝病患者，但我们在HBV感染诊治研究方面仍处于落后状态。就HBV定量技术而言，目前尚未建立分子杂交定量分析技术，现已报告的PCR定量分析法也属于低水平重复，今后有必要重视这方面的投资和开发。在临床研究领域应当有自己的立足点，不应简单重复国外研究结果。就HBV DNA定量分析意义的研究而言，简单重复的现象已不鲜见，必须引以为戒。

  参考文献

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  3. Brunetto MR, Giarin M, Saracco G, et al: Hepatitis B virus unable to secrete e antigen and response to interferon in chronic hepatitis B. Gastroenterology. 1993; 105: 845.

  4. Ryff JC: To treat or not to treat? The judicious use of interferon-alpha-2a for the treatment of chronic hepatitis B. J Hepatol. 1993; 17 Suppl 3: S42.

  5. Janssen HL, Schalm SW, Berk L et al;: Repeated courses of alpha-interferon for treatment of chronic hepatitis type B. J Hepatol. 1993; 17 Suppl 3: S47.

  6. Mels GC, Bellati G, Leandro G ,et al : Fluctuations in viremia, aminotransferases and IgM antibody to hepatitis B core antigen in chronic hepatitis B patients with disease exacerbations. Liver. 1994; 14: 175.

  7. Jilbert AR, Wu TT, England JM, et al: Rapid resolution of duck hepatitis B virus infections occurs after massive hepatocellular involvement. J Virol. 1992; 66: 1377

  8. Naito M, Hayashi N, Hagiwara H, et al: Serial quantitative analysis of serum hepatitis C virus RNA level in patients with acute and chronic hepatitis C. J Hepatol. 1994; 20: 755

  9.Mazzaferro V, Brunetto MR, Pasquali-M, et al.Preoperative serum levels of wild-type and hepatitis B e antigen-negative hepatitis B virus (HBV) and graft infection after liver transplantation for HBV-related hepatocellular carcinoma. J Viral Hepat. 1997, 4: 235.

  10. Brunetto MR, Randone A, Ranki M, et al: Quantitative analysis of wild-type and HBeAg minus hepatitis B viruses by a sequence-dependent primer extension assay. J Med Virol. 1994; 43: 310.

  11. Ballard AL and Boxall EH: Colourimetric point mutation assay: for detection of precore mutants of hepatitis B. J Virol Methods. 1997; 67: 143

  12. Dash S, Halim AB, Tsuji H, et al: Transfection of HepG2 cells with infectious hepatitis C virus genome. Am J Pathol. 1997; 151: 363

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  14. Erhardt A, Schaefer S, Athanassiou N, et al: Quantitative assay of PCR-amplified hepatitis B virus DNA using a peroxidase-labelled DNA probe and enhanced chemiluminescence. J Clin Microbiol. 1996; 34: 1885

  15. Moriyama K, Okamoto H, Tsuda F, et al: Reduced precore transcription and enhanced core-pregenome transcription of hepatitis B virus DNA after replacement of the precore-core promoter with sequences associated with e antigen-seronegative persistent infections. Virology. 1996; 226: 269.

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